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Détails sur le produit:
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| Nom de produits: | qPCR | Température de stockage: | – °C 20 |
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| Robuste et actif pour la synthèse de cDNA: | jusqu'à 55°C. | Application: | ACP |
| Volume: | 1ml | Transcription inverse: | température ambiante (42-60°C) |
| Surligner: | Multiplex universel QPCR de TaqMan,Réactif biochimique du multiplex QPCR de TaqMan,multiplex QPCR de 1ml TaqMan |
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Mélange principal de TaqMan de qPCR universel de multiplex
Conceptions de bases d'amorce :
1. La longueur du produit d'amplification est recommandée pour être entre le point d'ébullition 80-300 ;
2. Longueur d'amorce : 18-25 point d'ébullition ;
3. Le contenu de la base G+C dans des amorces devrait être entre 40%-60% ;
4. La différence de valeur du TM entre les amorces en avant et les amorces inverses est moins que 2℃, et la valeur du TM entre 58-62℃ est la meilleure ;
5. Caractère aléatoire de distribution basse ;
6. Les amorces ne devraient pas contenir des ordres auto-complémentaires, autrement elles formeront une structure secondaire d'épingle à cheveux ;
7. Il devrait y avoir pas plus de 4 complémentaires ou bases homologues entre deux amorces, autrement le dimère d'amorce sera formé, particulièrement chevauchement complémentaire au 3' extrémité ;
8. Le 3' base terminale de l'amorce est suggéré pour être G ou C ;
9. Aucun autre produit non spécifique n'a été trouvé dans des résultats de comparaison de NCBI.
Introduction du mélange principal de TaqMan de qPCR universel de multiplex :
Ce produit est une solution du prémélange 2x pour le qPCR suivre la méthode chimérique de fluorescence du vert I de GSK. Le composant de noyau, ADN polymérase de Taq, est un ADN polymérase chaleur-activé bloqué par la méthode d'anticorps, qui peut effectivement empêcher l'amplification non spécifique dans des conditions de basse température. En attendant, combiné avec le tampon de réaction a optimisé pour le qPCR, l'ADN polymérase de Taq est très approprié à la réaction élevée de qPCR de spécificité et de sensibilité. Une bonne courbe standard peut être obtenue en secteur quantitatif large, qui est précis, reproductible et fiable pour l'analyse quantitative des gènes de cible. En même temps, ce produit contient un colorant passif spécial de référence de ROX qui convient pour l'usage dans des tous les instruments de qPCR, et il n'y a aucun besoin d'ajuster la concentration de ROX sur différents instruments. Le colorant bleu est ajouté dans le prémélange, qui a l'effet de traceur d'ajouter des échantillons, et le diluant jaune de calibre est fourni en même temps. Quand le calibre est dilué avec le diluant jaune de calibre et s'est ajouté dans le prémélange bleu de réaction, les changements de couleur du bleu au vert, qui peut jouer un rôle de traceur dans la préparation du processus de système de réaction et empêcher la fuite ou le misaddition. Les éventails des colorants bleus et jaunes ne recouvrent pas avec les colorants de qPCR et n'affectent pas les résultats de réaction.
Protocole/procédures d'analyse au sujet du mélange principal de TaqMan de qPCR universel de multiplex :
1. Dilution (facultative) de calibre :
Ce kit fournit un tampon JAUNE de dilution du calibre 40x, une dilution jaune de calibre diluée 40 par fois qui peut être employée pour déterminer exactement si le calibre a été ajouté au fluide de réaction de qPCR en changeant la couleur du liquide. La prise du système de réaction du qPCR 20ul comme exemple, selon la quantité de calibre de dilution s'est ajoutée dans la solution de réaction du qPCR 20ul, la méthode correspondante de dilution de calibre original peut être mentionnée la table suivante (prenant le calibre original dilué à 100ul comme exemple) :
| Ajoutez le calibre dilué à la solution de réaction du qPCR 20ul (l'UL) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Ajoutez le tampon de dilution de calibre du JAUNE 40x au système de dilution du calibre 100ul (l'UL) | 50 | 25 | 16,7 | 12,5 | 10 | 8,4 | 7,2 | 6,3 |
| Ajoutez le système de dilution du calibre 100ul au calibre primaire (l'UL) | x | x | x | x | x | x | x | x |
| volume d'ajouter la nucléase - l'eau libre (UL) | 50-x | 75-x | 83.3-x | 87.5-x | 90-x | 91.6-x | 92.8-x | 93.7-x |
Exemple :
2ul a dilué le calibre devrait être ajouté au système de réaction du qPCR 20ul.
Prenant le système de dilution du calibre 100ul comme exemple, quand le volume original de calibre est 20ul, le tampon jaune de dilution de calibre de 25ul 40x est ajouté, et alors l'eau sans nucléase 55ul est ajoutée à tout le volume de 100ul.
Le TAMPON JAUNE de DILUTION du CALIBRE 40x est maintenant 10x. Ajoutez 2ul du calibre dilué dans un tampon de dilution de la dilution 20ul, et le tampon final de dilution de calibre du JAUNE 40× est 1x. En conclusion, le tampon jaune de dilution de calibre devrait être 1x dans le système final de qPCR.
L'information produit du mélange principal de TaqMan de qPCR universel de multiplex :
| Nom de produit | Identification de produit | Modèle |
| Mélange principal de TaqMan de qPCR universel de multiplex | GS-MBP0044-01 | 1ml |
| GS-MBP0044-05 | 5×1 ml | |
| GS-MBP0044-15 | 15×1 ml |
Conditions de stockage et de manipulation avec le mélange principal de TaqMan de qPCR universel de multiplex :
Transport humide de sac de glace ; Stocké à la température de -20℃, valable 12 mois.
Note : Si le calibre n'a pas besoin d'être dilué, ou si le diluant de calibre de G3362-2 n'est pas employé, vous pouvez ignorer cette étape.
2. procédure de réaction d'ACP (peut être ajusté selon les instruments) :
a : Si la spécificité d'amplification doit être améliorée, la température de procédure en deux temps ou de recuit peut être employée ; Pour améliorer l'efficacité d'amplification, une procédure en trois temps ou un temps d'extension peut être employée.
Note :
1. Veuillez porter les gants jetables lors du fonctionnement pour éviter la contamination de RNase.
2. Les produits inverses de transcription peuvent être stockés à -20℃ pendant une courte période. Si l'entreposage à long terme est nécessaire, on lui recommande de les stocker à -80℃ après emballage pour éviter les cycles gel-dégel répétés.
3. Si le calibre est d'origine eucaryotique, on lui recommande de choisir (décollement) l'amorce 18 Oligo et l'appareille avec le 3' poly une queue de l'ADN messagère eucaryotique pour obtenir le rendement le plus élevé de cDNA intégral.
4. Pour la transcription inverse de l'ARN procaryotique, l'amorce aléatoire ou le Gene Specific Primer de Hexamer devrait être employée.
5. L'amorce aléatoire de Hexamer a l'applicabilité large et convient à l'ADN messagère, au rRNA, au tRNA, au petit ARN et aux calibres de lncRNA.
6. Si la transcription inverse est suivie d'analyse de qPCR, (décollement) l'amorce 18 Oligo et l'amorce aléatoire de Hexamer peuvent être mélangées pour faire à efficacité de synthèse de cDNA dans toutes les régions d'ADN messagère la même chose, qui aide à améliorer l'authenticité et la répétabilité des résultats quantitatifs.
7. Si les amorces suivantes de qPCR sont conçues à travers des exons, l'étape de retrait de génome peut être omise.
Problèmes communs et solutions :
| Description de problème | Raisons possibles | Solutions |
| À la fin de la réaction, aucune courbe d'amplification n'est apparue ou la valeur de CT est apparue trop en retard | La concentration de calibre est si basse | Répétez l'expérience pour réduire le multiple de dilution de calibre, et le début de la concentration la plus élevée quand la concentration d'échantillon est inconnue |
| Dégradation de calibre | Le calibre a été préparé encore et l'expérience a été répétée | |
| Il y a des inhibiteurs d'ACP dans le système | Généralement, le calibre est porté dedans, le rapport de dilution du calibre est augmenté ou le calibre avec la grande pureté reprepared et est répété | |
| Les amorces peuvent dégrader | Des amorces qui n'ont pas été utilisées pendant longtemps devraient d'abord être examinées pour l'intégrité par l'électrophorèse de PAGE pour éliminer la possibilité de dégradation | |
| Basse efficacité d'amplification | le ncrease la concentration en amorce, essayent une procédure en trois étapes d'amplification, ou remodèlent l'amorce | |
| Le produit d'amplification est trop long | La longueur de produit d'amplification a été commandée de l'ordre du point d'ébullition 80-300 | |
| Le contrôle vide montre le signal | Pollution de système de réaction | Premièrement, l'eau de contrôle vide devrait être remplacée. Si la même situation se produit toujours, les amorces, les aspirateurs et les tubes d'ACP devraient être remplacés ou un nouveau mélange principal devrait être commencé. Le système de réaction est préparé dans une table propre superbe pour réduire la pollution d'aérosol |
| L'amplification non spécifique telle que des dimères d'amorce apparaît |
Généralement, il est normal que les produits d'amplification apparaissent dans le contrôle vide après 35 cycles, qui devraient être analysés avec la courbe de fusion. L'amorce de nouvelle conception, ajustent la concentration en amorce ou optimiser la procédure de réaction d'ACP |
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| La courbe de fusion a les crêtes multiples | La conception d'amorce est pauvre | La nouvelle amorce a été remodelée selon les conceptions de bases d'amorce |
| La concentration en amorce est trop haute | Réduisez la concentration en amorce convenablement | |
| Il y a de contamination genomic dans le calibre de cDNA | La solution extraite d'ARN est digérée utilisant des enzymes d'ADN, telles que DSDNase, pour enlever la contamination genomic, ou pour concevoir des amorces de transintron | |
| Reproductibilité pauvre des expériences | L'erreur d'ajouter l'échantillon est grande |
L'utilisation de la pipette précise, avec la pipette précise de tête de haute qualité d'aspiration ; Calibre élevé de dilution, ajoutant le calibre de large volume pour réduire l'erreur d'échantillonnage ; Le volume de réaction de qPCR a été agrandi |
| La concentration de calibre est si basse | Répétez l'expérience pour réduire les temps de dilution du calibre | |
| Déviation de la température à différents emplacements de l'instrument de qPCR | Calibrez l'instrument de qPCR régulièrement | |
| La courbe d'amplification n'est pas lisse | Le signal de fluorescence est trop faible, produit après correction de système |
Assurez-vous que les colorants prémélangés dans le mélange principal ne sont pas dégradés ; Remplacez le signal fluorescent pour rassembler mieux des consommables de qPCR |
| Coupures ou glissements de courbe d'amplification | La concentration de calibre était plus haute et la valeur de point final de ligne de base était plus grande que la valeur de CT | Le point final de ligne de base (valeur -3 de Ct) a été réduit et les données ont été réanalysés |
| Les courbes d'amplification de Wells individuel soudainement se sont laissées tomber brusquement | Il y a des bulles dans le tube de réaction |
Assurez-vous que le MÉLANGE est complètement dissous, et ne tourbillonnez pas et n'oscillez pas également ; Après que l'échantillon soit ajouté, les bulles sont enlevées par centrifugation avec l'élastique léger. L'heure de pré-dénaturation a été prolongée à la minute 10 d'enlever les bulles |
Si vous avez besoin de plus d'informations au sujet du mélange principal de TaqMan de qPCR universel de multiplex, svp faites-nous savoir en ligne, merci.
Personne à contacter: Ms. Kris Zhang
Téléphone: 0086-0769-85914911
